MSU Nanotechnology Education and Research Center

IV курс, VIII семестр, специализация «Нанобиоматериалы и нанобиотехнологии» (подгруппа НБ1).

Практикумы проводят — с.н.с., к.б.н. Киреев Игорь Игоревич (НИИ Физ.-хим. биологии имени А.Н. Белозерского МГУ); ассист. Евтушенко Евгений Геннадиевич (химический факультет МГУ); доц., к.х.н. Литманович Екатерина Аркадьевна (химический факультет МГУ); н.с., к.х.н. Мажуга Александр Георгиевич (химический факультет МГУ).

32 лабораторных часа.

Расписание проведения задач.

Данный лабораторный курс предназначен для закрепления теоретических знаний в области нанодиагностики и визуализации нанобиоструктур. На конкретных примерах нанобиоматериалов студенты получают практические навыки подготовки образца к измерению, знакомятся с устройством приборов, производят выбор наиболее подходящего режима измерений, а также решают задачи интерпретации результатов и их представления в виде, требуемом для публикаций.

Цикл задач, помимо получения специфических знаний и навыков, присущих каждому методу исследования, несет в себе задачу обучения студентов комплексному исследованию нанообъектов. Студенты проходят весь путь от получения нанообъектов, наночастиц золота (Задача №1), через их исследование целым набором современных методов: СЭМ (Задача №2), СЗМ (Задача №3), DLS (Задача №4), NTA (Задача №5) спектроскопия видимой области (Задача №6) к модификации полученных наночастиц биомолекулами и изготовлению на их основе конечного продукта — иммунохроматографических тест-полосок (Задача №6).

Задача №1. Получение золя наночастиц золота восстановлением его солей цитратом натрия

Целью практикума является ознакомление студентов с основным методом синтеза золотых наночастиц в области размеров от 10 до 45 нм — цитратным восстановлением золотохлористоводородной кислоты (метод Туркевича). Наблюдение за изменением окраски реакционной смеси в ходе синтеза, а также электронных спектров поглощения готовых наночастиц помогают закрепить полученные в курсе «Физика наноструктур» знания о явлении локализованного поверхностного плазмонного резонанса. Набор практических рекомендаций, а также анализ типичных ошибок, допускаемых в ходе процесса, помогут студентам воспроизвести этот несложный синтез в собственных экспериментальных исследованиях в случае необходимости.

Задача №2. Электронная микроскопия в бионанотехнологии

Целью практикума является ознакомление с устройством и принципом работы просвечивающего электронного микроскопа, освоение базовых методов приготовления препаратов различных типов биоматериалов (клетки и ткани, вирусы, макромолекулы) для электронномикроскопического анализа (метод ультратонких срезов, негативное контрастирование), знакомство с методами иммуноэлектронной микроскопии. Дополнительной задачей практикума является исследование полученных студентами образцов наночастиц золота методом просвечивающей электронной микроскопии.

План занятий:

• 1 день: Приготовение реактивов для фиксации, негативного контрастирования и иммуноэлектронной микроскопии. Изготовление пленки-подложки для образцов. Фиксация и иммуноокрашивание образцов клеток млекопитающих, культивируемых на покровных стеклах. Знакомство с устройством просвечивающего микроскопа. Основные функциональные узлы микроскопа, управление микроскопом. Приготовление препаратов вируса табачной мозаики методом негативного контраста.
• 2 день. Ag-амплификация сигнала на препаратах клеток, фиксированных накануне. Оценка качества окрашивания и амплификации при помощи светового микроскопа. Обезвоживание и инфильтрация препаратов эпоксидной смолой. Просмотр препаратов вирусов, полученных накануне. Полимеризация эпоксидных блоков. Выбор клеток для ультрамикротомии и тримминг блоков. Приготовление образцов наночастиц золота для изучения.
• 3 день. Знакомство с техникой ультратонких срезов. Изготовление стеклянных ножей. Получение ультратонких срезов (демонстрация). Контрастирование срезов. Просмотр и фотографирование препаратов. Обсуждение результатов.

Приборная база: практикум будет проводиться на базе приборного парка отдела электронной микроскопии НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского. В отделе имеется два просвечивающих микроскопа HU-12 (80-100 kV) и H-700 (200 kV) (Hitachi), несколько ультрамикротомов и другое оборудование для пробоподготовки (напылительные установки, термостаты, найфмейкеры, оптические микроскопы и т.п.).

Задача №3. Использование метода Сканирующей Силовой Микроскопии для изучения белковых нанобиоструктур и золотых наночастиц

Данная практическая работа предназначена для закрепления полученных студентами знаний о теоретических основах Сканирующей Зондовой Микроскопии. В первую очередь, они знакомятся с устройством ключевых узлов Сканирующего Силового Микроскопа (ССМ) NT-MDT Solver P47 и общими практическими приемами приготовления образцов для ССМ, накладывающими ограничения на области применения метода. Немаловажным является также овладение первичными навыками работы на ССМ: знакомство с реализацией систем подвода-отвода, обратной связи, регистрации изгиба и/или амплитуды колебаний кантилевера, а также основным режимом получения топографии применительно к биологическим образцам — прерывисто-контактной силовой микроскопией («tapping-mode»).

В теоретической части задачи основные принципы ССМ изложены кратко, так как они уже знакомы студентам из лекционных занятий. Основное внимание уделено теоретическим основам выбора корректных условий получения ССМ-изображений, анализу артефактов и искажающих факторов метода. Второстепенной задачей данной работы является ознакомление с процедурами обработки и анализа данных ССМ-топографии. Данная задача несомненно важна для будущих ученых, так как примерно в трети публикуемых работ, содержащих данные ССМ-топографии, обработка изображений либо не проводится, либо осуществляется некорректно, что значительно снижает их информативность.

Объектом изучения данной задачи являются белковые нанотрубки, образованные белком GP18 фага T4. Данные нанообъекты представляют собой наглядный пример принципа самосборки структур с уникальной геометрией из мономерных белковых глобул.

Дополнительным объектом являются золотые наночастицы, адсорбированные на поверхность высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ). Помимо характеризации препарата, данный объект представляет выгодные возможности рассмотрения различных артефактов, искажений и эффектов АСМ: конволюции, сдвига частиц зондом, многовершинности зонда, режима фазового контраста для различных материалов поверхности.

Задача №4. Измерение размера наночастиц золота методом динамического светорассеяния (DLS)

Метод динамического светорассеяния (DLS) является общепризнанным научным и промышленным стандартом для измерения размера наночастиц в коллоидных растворах. На практикуме студенты закрепляют полученные на лекциях теоретические знания об основах метода DLS, знакомятся с устройством прибора (PhotoCorr), а также получают практические навыки подготовки образца к измерению, проверки корректности проведения измерения и интерпретации полученных первичных результатов (автокорреляционной функции).

Задача №5. Характеризация препаратов золотых наночастиц методом Анализа траекторий наночастиц (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)

Метод Анализа траекторий наночастиц (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA) – один из недавно появившихся методов многосторонней характеризации наночастиц в растворах. Знакомство студентов с этим современным и мощным методом измерения размеров частиц несомненно полезно для подготовки современных и востребованных кадров в области нанотехнологий.

Задача №6. Приготовление конъюгатов золотых наночастиц с белками и использование их для изготовления иммунохроматографических тест-полосок

Данная практическая работа предназначена для ознакомления студентов с методом быстрой конъюгации золотых наночастиц с белками; устройством, принципами функционирования и общей методикой изготовления иммунохроматографических тест-систем.

Данная работа является завершающей в цикле практических работ, проводящих студентов через весь путь от собственноручного синтеза нанообъектов (золотых наночастиц), через их характеризацию с помощью современных физических методов (ПЭМ, ССМ, DLS, NTA) и модификацию их биомолекулами, к созданию на их основе конечного продукта.

В теоретической части задачи рассмотрены основные принципы предлагаемого к использованию метода физической адсорбции белка на золотых наночастицах и проверки степени связывания путем дестабилизации коллоида растворами с высокой ионной силой. Большое внимание уделено принципам работы иммунохроматографических тест-полосок, а также практическим требованиям, предъявляемым к материалам, используемым для их изготовления.

В практической части задачи студенты знакомятся с приемами работы с золями золотых наночастиц, способами оценки их стабильности как визуально, так и при помощи спектроскопии видимой области. Важной частью задачи является ознакомление студентов с принципами функционирования белкового принтера.