Основы генной инженерии
IV курс, VII семестр, специализация «Наноструктуры биологической мембраны» (подгруппа НБ2).
Шатский Иван Николаевич (д.х.н., главный научный сотрудник МГУ, профессор).
Студент должен иметь представление о современных проблемах генной инженерии, ее методах, достижениях и принциапиальных трудностях. Должен иметь знания о плазмидах и их применении в генной инженерии, использовании фагов, способах отборов колоний, принципах секвенирования ДНК, методе ПЦР, методе космид, челночных векторах, сай-направленном мутагенезе, эмбриональных стволовых клетках, идентификации белок-белковых партнёров.
Программа
Значение генной инженерии в современной биологии и медицине. Общие представления о способах манипуляции с генами. Эндонуклеазы рестрикции. Разрезание и соединение нуклеотидных последовательностей ДНК. Плазмидные векторы: строение, необходимые элементы, методы трансфекции в компетентные клетки, выделение. Разрезание и соединение нуклеотидных последовательностей ДНК. Методы отбора и идентификации колоний и фаговых бляшек, содержащих искомый ген. Фаг лямбда и его использование в качестве вектора. Методы скрининга фаговых библиотек. Принципы секвенирования ДНК. Космиды. Геномные библиотеки. Упаковка космидных ДНК в фаговые частицы in vitro. Полимеразная цепная реакция. Taq и Pfu полимеразы: области применения. Сайт- направленный мутагенез. Получение кДНК и создание кДНК-библиотек. Полимеразы Т- нечетных фагов: получение РНК in vitro. Экспрессирующие плазмидные векторы, экспрессия белков в клетках E.сoli. Методы получения и очистки рекомбинантных белков из клеток E.coli, области применения. Бакуловирусные системы получения рекомбинантных белков. Челночные векторы. Транзитная (временная) и постоянная трансфекция животных клеток. Методы трансфекции. Принципы получения трансгенных животных. Эмбриональные стволовые клетки мыши. Получение линий мышей с нокаутом по определенному гену. РНК-интерференция и генный нокдаун. Идентификация белок-белковых партнеров с помощью дрожжевой двугибридной системы.
Список литературы
С.Н. Щелкунов. Генетическая инженерия: Учебно-справочное пособие. 2-е издание, испр. и доп. Новосибирск: Сибирское унив. изд-во, 2004. ISBN 5-94087-098-8.
Аннотированный список лекций
Лекция 1. Плазмидные векторы. Строение, необходимые элементы, методы трансфекции в компетентные клетки, выделение плазмид, анализ рекомбинантных ДНК методами рестриктного анализа.
Разрезание и соединение нуклеотидных последовательностей ДНК. Основные приемы, используемые для клонирования ДНК-фрагментов в плазмидные векторы и лямбда-векторы при создании библиотек.
Лекция 2. Методы отбора и идентификации колоний и фаговых бляшек, содержащих искомый ген. Метод бело-голубых колоний для предварительной селекции клонов, содержащих вставку ДНК в использованном векторе.
Строение ДНК фага лямбда. Лизогенное и литическое состояние фага. Общие представления о репликации и упаковке фага в вирусные частицы.
Лекция 3. Упаковка рекомбинантных ДНК в лямбда фаг-подобные частицы in vitro. Методы скрининга фаговых библиотек для выявления и получения рекомбинантного фага, несущего нужный экспериментатору ген.
Лекция 4. Принципы секвенирования ДНК в ручном и автоматическом вариантах. Геномные библиотеки. Их отличие от библиотек кДНК. Этапы их получения, исходя из суммарной ДНК, выделенной из каких-либо клеток.
Лекция 5. Космиды. Строение, область использования, преимущества использования космид по сравнению с другими векторами для определения структуры геномов, упаковка космидных ДНК в фаговые частицы in vitro.
Лекция 6. Полимеразная цепная реакция. Выбор условий проведения реакции, подбор праймеров, выделение ПЦР-продуктов из реакционной смеси.
Подходы к клонированию ПЦР-фрагментов в плазмидные векторы. Создание векторов, пригодных для синтеза РНК in vitro с заданного участка ДНК.
Лекция 7. Taq и Pfu полимеразы. Области применения. Сайт- направленный мутагенез. Получение делеций и вставок в исследуемой последовательности ДНК с помощью полимеразной цепной реакции. Получение кДНК и создание кДНК-библиотек. Области использования кДНК-библиотек.
Лекция 8. Полимеразы Т- нечетных фагов. Отличия от РНК-полимеразы E.coli, область применения. Получение РНК in vitro, области использования синтезированных РНК. Экспрессирующие плазмидные векторы, экспрессия белков в клетках E.сoli и проблемы, которые при этом могут возникнуть, отличия рекомбинантных белков от нативных. Методы получения и очистки рекомбинантных белков из клеток E.coli, области применения. Использование бакуловирусов для получения рекомбинантных белков.
Лекция 9. Челночные векторы. Требования к строению эукариотических векторов для эффективной экспрессии в животных клетках исследуемого белка или репортерного белка. Транзитная (временная) и постоянная трансфекция животных клеток. Метод отбора колоний клеток с постоянной экспрессией.
Принципы получения трансгенных животных.
Лекция 10. Эмбриональные стволовые клетки мыши. Источник выделения, культивирование, модификация генов, получение линий мышей с нокаутом по определенному гену. РНК-интерференция и генный нокдаун.
Лекция 11. Идентификация белок-белковых партнеров с помощью дрожжевой двугибридной системы.
Промежуточная аттестация
Коллоквиум “Полимеразная цепная реакция (ПЦР)”. Студенты получают конкретную нуклеотидную последовательность из геномного банка и должны рассказать, как они будут выделять эту область с помощью ПЦР, рассказать обо всех возможных трудностях, которые могут встретиться в ходе эксперимента и как обойти эти трудности. Рассказать обо всех способах клонирования выделенного ПЦР-фрагмента в конкретный вектор. Провести с помощью ПЦР замену аминокислоты в заданном участке конкретного белка.
Список вопросов в билетах
1. Полимеразная цепная реакция. Выбор условий проведения реакции, подбор праймеров, выделение ПЦР-продуктов из реакционной смеси и их клонирование в вектор.
2. Эмбриональные стволовые клетки мыши. Источник выделения, культивирование, модификация генов, получение линий мышей с нокаутом по определенному гену.
3. Плазмидные векторы. Строение, необходимые элементы, методы трансфекции в компетентные клетки, выделение плазмид, анализ рекомбинантных ДНК методами рестриктного анализа и сиквенирования.
4. Получение РНК in vitro, области использования синтезированных РНК.
5. Фаг лямбда. Общее строение, преимущества его использования в качестве вектора перед плазмидными векторами, использование для создания геномных и к ДНК-библиотек.
6. Рекомбинантные белки, методы получения и очистки из клеток E.coli, области применения.
7. Получение кДНК и создание кДНК-библиотек. Области использования кДНК-библиотек.
8. Принципы определения последовательности нуклеотидов в ДНК.
9. Экспрессирующие плазмидные векторы, экспрессия белков в клетках E.сoli и проблемы, которые при этом могут возникнуть, отличия рекомбинантных белков от нативных.
10. Идентификация белок-белковых партнеров с помощью дрожжевой двугибридной системы.
11. Космиды. Строение, область использования, преимущества использования космид по сравнению с другими векторами для определения структуры геномов, упаковка космидных ДНК в фаговые частицы in vitro.
12. Методы скрининга фаговых библиотек для выявления и получения рекомбинантного фага, несущего нужный экспериментатору ген.
13. Геномные библиотеки. Их отличие от библиотек кДНК. Рассказать обо всех этапах их получения, исходя из суммарной ДНК, выделенной из каких-либо клеток.
14. Сайт-направленный мутагенез.
15. Упаковка рекомбинантных ДНК в фаговые частицы in vitro.
16. Принципы получения трансгенных животных.
17. Получение кДНК. Описать последовательно все этапы получения кДНК, начиная с этапа выделения мРНК.
18. Полимеразы Т- нечетных фагов. Отличия от РНК-полимеразы E.coli, область применения.
19. Упаковка рекомбинантных ДНК в лямбда фаг-подобные частицы in vitro.
20. Сайт-направленный мутагенез с использованием полимеразной цепной реакции.
21. Подходы к клонированию ПЦР-фрагментов в плазмидные векторы. Создание векторов, пригодных для синтеза РНК in vitro с заданного участка ДНК.
22. Генный нокаут и генный нокдаун.
23. Челночные векторы. Требования к строению эукариотических векторов для эффективной экспрессии в животных клетках исследуемого белка или репортерного белка. Транзитная (временная) и постоянная трансфекция животных клеток. Метод отбора колоний клеток с постоянной экспрессией.
24. Получение кДНК, обогащенной 5’-концевыми последовательностями мРНК. Метод RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends).
25. Методы отбора и идентификации колоний и фаговых бляшек, содержащих искомый ген. Метод бело-голубых колоний для предварительной селекции клонов, содержащих вставку ДНК в использованном векторе.
26. Принципы идентификации индивидуальных геномов с помощью полимеразной цепной реакции.
27. Строение ДНК фага лямбда. Лизогенное и литическое состояние фага. Общие представления о репликации и упаковке фага в вирусные частицы.
28. Принципы секвенирования ДНК в ручном и автоматическом вариантах.
29. Разрезание и соединение нуклеотидных последовательностей ДНК. Основные приемы, используемые для клонирования ДНК-фрагментов в плазмидные векторы и лямбда-векторы при создании библиотек.
30. Методы введения чужеродной ДНК в бактериальные и животные клетки.
31. Т7 полимераза, свойства, отличия от РНК-полимеразы E.coli, использование для получения РНК с исследуемой ДНК и для получения рекомбинантных белков.
32. Термостабильные ДНК-полимеразы. Taq и Pfu полимеразы. Области применения. Получение делеций и вставок в исследуемой последовательности ДНК с помощью полимеразной цепной реакции.
33. Экспрессирующие плазмидные векторы, экспрессия белков в клетках E.сoli и проблемы, которые при этом могут возникнуть, отличия рекомбинантных белков от нативных.
34. Идентификация белок-белковых партнеров с помощью дрожжевой двугибридной системы.
